DEAE-Cellulose カラム

 硫安分画により粗精製を行った後に、さらに IgG 画分まで精製する場合に DEAE-Cellulose カラムを用いる。イムノグロブリンは一般のタンパクに比べてかなり強く正に帯電しているため、陰イオン交換カラムである DEAE-Cellulose カラムを素通りする。

(使用する薬品類)

 

(方法)

  1. DEAE-Cellulose 0.5g を 0.5N HCl 10ml に浮遊させる。

    (使用する DEAE-Cellulose 重量は、作製するカラムのサイズにより変える。通常の活性化においては乾燥重量 0.10〜0.11g で 1mlのゲル体積になる)

  2. ゲル浮遊液をよくかく絆する。
  3. グラスフィルターで吸引ろかする。
  4. 洗液が中性付近になるまで MillQ 水でゲルを洗浄する。
  5. ゲルをかきとって、0.5N NaOH 10ml に浮遊させる。
  6. ゲル浮遊液をよくかく絆する。
  7. グラスフィルターで吸引ろかする。
  8. 洗液が中性付近になるまで MilliQ 水でゲルを洗浄する。
  9. ゲルをかきとって、0.17M Na-Phosphate buffer 25ml に懸濁する。
  10. 注射筒にゲルを充填する。

    ※注射筒カラムの作製法

  11. 0.017M Na-Phosphate buffer でカラムを平衡化する。(ゲル体積の約 5 倍程度の体積)
  12. 0.017M Na-Phosphate buffer に対して透析したサンプルをカラムに負荷する。
  13. 0.017M Na-Phosphate buffer で溶出する。1ml ずつ分取し、OD280 が十分小さな値になるまで行う(通常ゲル体積の 5〜10 倍)
  14. 0.5M NaCl で吸着タンパクを溶出して、ゲルが正常に活性化されていたことを確認する。(1ml のゲルで約 10 OD280 程度のタンパクを吸着できる。)

※DEAE-Cellulose カラムからの IgG1 抗体の典型的な溶出曲線

 


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